N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG）試劑盒

正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

NAG是溶酶體中的一種酸性水解酶，廣泛存在于各種組織、體液和細(xì)胞中，以前列腺和腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)含量最高。NAG活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。

測定原理：

NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計(jì)算NAG活性。

自備用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體13mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測定吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測定-A對照。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。

NAG活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x +0.0083；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）NAG活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷V樣÷T =39.89×(ΔA-0.0083)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中NAG活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA-0.0083)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x +0.0083；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）NAG活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷V樣÷T =59.83×(ΔA-0.0083)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中NAG活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA-0.0083)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

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